环状RNA( circRNA )是共价闭合的单链RNA，由真核细胞中的各种机制从线性前体产生。在动物中，circRNA有四个亚类：外显子circRNA(ecircRNA)、外显子-内含子circRNA(EIciRNA)、内含子衍生的circRNA和线粒体编码的circRNA(mecciRNA) 。EIciRNAs由外显子和内含子序列组成，ecircRNAs由外显子序列形成，是通过细胞核中的反向剪接产生的，而ecircRNAs占真核circRNAs的大部分。EcircRNA主要定位于细胞质。尽管有证据表明核输出过程受称为果蝇Hel25E的DDX解旋酶及其哺乳动物同源物DDX39A和DDX39B调节，但数千个ecircRNA被转运到细胞质中的机制仍然难以捉摸。

2022年10月，中国科学技术大学单革及重庆大学黄川团队提供了一系列证据来证明保守的Exportin4(XPO4)与后生动物中一部分circRNA的核输出之间的联系。具有较高表达水平、较大长度和较低GC含量的外显子circRNA（ecircRNA）对XPO4缺乏更敏感。

该文章发表在Nature Communications上。

在哺乳动物中，大脑和睾丸是ecircRNA丰度最高的器官。在哺乳动物神经元中，neuropils富含ecircRNA，从而表明主动运输和定位机制。敲除单个circRNA，例如富含细胞质和大脑特异性的circRNACdr1as，会导致兴奋性突触传递、记忆和探索行为异常。最近还有一个论点，即基于哺乳动物的进化分析，大多数circRNA可能是非功能性的并且是剪接“错误” 。另一方面，circRNA的失调也被证明与一系列人类疾病有关，包括退行性疾病，如阿尔茨海默病，而circRNA水平的变化与衰老等生理过程有关。

研究结果揭示了XPO4在ecircRNAs核输出中的保守作用，并证明ecircRNAs的有效核输出对动物和人类细胞至关重要。该研究阐明了对circRNA输出机制的理解，并揭示了circRNA高效核输出在细胞生理学中的意义。

实验部分

使用TissueGnostics公司TissueFAXS Plus全景组织细胞定量分析系统获取小鼠脑海马体样本（S9.6(ciR-loop)，DAPI；S9.6(R-loop)，DAPI；γH2A.X，DAPI；NeuN，DAPI）图像。

Figure 1： XPO4剂量不足可导致XPO4^+/−小鼠神经功能障碍。

a : Xpo4^+/+和Xpo4^+/−小鼠海马区ciR-loop免疫荧光图像。

b : Xpo4^+/+和Xpo4^+/−小鼠海马区R-loop免疫荧光图像。

C : Xpo4^+/+和Xpo4^+/−小鼠海马区γH2A.X（DNA损伤）免疫荧光图像。

d : Xpo4^+/+和Xpo4^+/−小鼠海马区NeuN免疫荧光图像。

TissueFAXS Cytometry技术是针对组织原位多色荧光成像及分析的整体化解决方案，文中作者采用了免疫荧光的方法，分别对小鼠海马体中ciR-loop、R-loop、γH2A.X以及NeuN的整体荧光强度的表达量进行了原位数据结果的成像，但是在此基础上，TG可以帮助用户实现更进一步的精准量化分析。

例如在分析的目标中，TG可以实现原位单细胞水平量化分析，使用DAPI通道识别到每个细胞核后，以细胞核为核心寻找细胞核内的信号，或者根据染色目标蛋白的亚细胞结构定位，识别细胞核外至细胞膜为止的所有细胞质区域中所有信号的表达，最终数据可以通过二维流式散点图呈现在组织中每个细胞的信号情况。

文中作者同时还使用了FISH技术针对目标核酸片段进行了荧光原位探针检测，这部分数据在TG系统中的呈现，除了获得单个细胞中荧光探针点状信号的数量，还可以获得单个荧光信号点的强度关系，甚至在单个细胞中这些核酸片段的空间作用关系。通过这种方法，研究者不但能够做出“有”或“无”的定性判断，更可以通过其精准的表达强度，对其单个细胞内“高表达”或“低表达”做出精准的判断，还可以进一步探索其“重要程度”和“相互影响”的组织原位空间作用。

更有意思的是，TG可以支持蛋白-核酸共标记样本的量化分析：通过RNAScope染色技术，可以支持在一张样本上同时标记核酸和蛋白质信号，TG技术可以通过组织原位的蛋白表达量及表达面积的情况，先从蛋白水平区分某个细胞亚型，再对此细胞亚型内的目标核酸片段进行量化分析。这一技术从原理上解决了核酸层面数据和蛋白层面数据在单个细胞水平上的整合难题，更借助TG全景定量的特点功能，一步实现了在整张样本上进行某亚型单细胞的精准量化分析，极大提升了组织原位的数据解析丰度。