Tissue Cytometry技术在临床免疫性疾病的转化医学研究

移植物抗宿主病(GvHD)不同于移植排斥反应,主要是由于移植后异体供者移植物中的T淋巴细胞,以受者靶细胞为目标,发动细胞毒性攻击而致病,特异性表现为上皮细胞的凋亡,多发生在皮肤、肠道及肝组织中。而在白血病的治疗中,由化学疗法和放射疗法之后的干细胞移植,通常也会引发GvHD,导致严重的不良炎症反应,尤其是在皮肤或肠道中。到目前为止,其特异性发生的原因尚不清楚。

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Science Translational Medicine

维也纳医学院皮肤科的Georg Stary和Johanna Strobl研究小组现已得到一种免疫机制影响因素。该结果发表在Science Translational Medicine杂志(IF=16.304)上。

白血病是一种用于描述造血系统癌化的恶性疾病,其中白细胞前体不受控制地增殖。针对白血病的治疗中,化学疗法和放射疗法用于破坏异常细胞,然后通过正常干细胞移植来替代。在白血病中,健康骨髓干细胞或造血干细胞的移植通常是患者康复的唯一希望。

研究发现,内源性免疫系统中存在所谓的皮肤驻留性T细胞和非活性T细胞,它们在化学疗法和放射疗法的保护下完好无损,并在上皮细胞之间和下方继续生存了十年,循环系统中的T细胞则被破坏殆尽。

在未发生移植物抗宿主病的患者中,治疗后残留的组织驻留T细胞甚至被证明对受体有益,因为他们承担了其在免疫防御和预防感染中的作用。

将来,该研究结果可能会导致新的治疗策略,该方法可通过预先操纵受体的非活性T细胞来帮助避免或至少最小化干细胞移植后不良的和剧烈的炎症反应。另外,对组织驻留T细胞进行针对性的调节可能有助于针对其他慢性炎性皮肤病,例如牛皮癣或神经性皮炎的新治疗方法的开发。

实验部分

利用TissueGnostics公司TissueFAXS系统对组织样本进行全景成像和TissueQuest /StrataQuest组织流式定量分析。

01

组织流式定量分析

利用StrataQuest软件对供体来源和宿主来源的T细胞通过X和Y染色体的自动定量分析,并由两名独立的复检者进行组织学验证。(分别在同一皮肤的四个单独部分取得样本)

02

X / Y-FISH

文章利用X / Y-FISH方法,对宿主/捐赠者源性的 T细胞进行了追踪。X / Y-FISH是一种快速筛选大量骨髓细胞中是否存在宿主细胞的有用方法。通过这种方法,研究者获得了在供体细胞输注后10年的时间跨度内,54例性别不匹配的HSCT患者的单一活检(活检部位,上臂健康外观皮肤n = 44;移植物抗宿主病损伤n = 10)的追踪数据。

文章作者使用20X物镜获得了组织学原位的全景图像后,在探针分子水平对样本中FISH信号进行了定量数据的获取以及不同实验组之间的数据分析。

*视频中本文作者Dr Johanna Strobl结合

Tissue Cytometry组织流式定量分析技术

对文章做了详细介绍。


Fig.1 αβTCR、CD3和CD69的免疫荧光染色图像。


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Fig.2 基因表达为基础的标记物识别抗放化疗的T细胞。

C:通过免疫荧光染色确定CCR7+和CD62L+皮肤T细胞相对数量。

D:CCR7和CD62L的免疫荧光染色。

E:通过免疫荧光染色确定CD69+和CD103+皮肤T细胞的相对数量。

F:CD69和CD103的免疫荧光染色,表明对放化疗耐药的皮肤驻留性T细胞。

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Fig. 3 allo-HSCT(异基因造血干细胞移植)后Long-term Trm保持10年

A:异基因造血干细胞移植后8年患者的FISH标记X(绿色)和Y(红色)染色体、CD3(黄色)和DAPI的图像。

B:HSCT后外周血(左)和皮肤T细胞(右)中宿主T细胞的百分比。

C:在异基因造血干细胞移植和采样时间点(n=5)之间有病毒性皮肤感染史的患者和allo-HSCT后无病毒性皮肤感染的患者皮肤中宿主T细胞的百分比。

D:移植前后指定时间供体和宿主皮肤T细胞对指定组织驻留标记物阳性的比例。

E:aGVHD1皮肤T细胞浸润的X和Y染色体(分别为绿色和红色)的CD3(黄色)和FISH。图片中的红色和绿色标记使用了TissueFAXS软件的自动组织细胞识别功能,其中红色圈选CD69阳性细胞,绿色圈出CD3单阳性细胞。

F:aGVHD1和cGVHD1中T细胞中宿主细胞的百分比。

G: 炎症皮肤中乳头状真皮和下表皮中宿主(XY,橙色箭头)和供体(XX,白色箭头)T细胞的空间关系图像。图像数据采用StrataQuest软件进行自动,所有T细胞(CD3+)都用箭头标记;未标记的细胞是其他类型的细胞。

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Fig. 4 宿主来源的Trm增殖导致GVHD皮肤炎症

C:Ki-67+CD69+T细胞/mm2的皮肤(左)和相对频率(右)。

D:Ki-67细胞表达在CD3+T细胞和CD3+CD69+T细胞中的频率。

E:X/Y-FISH和免疫染色识别GVHD中增殖(Ki-67+)T细胞(左)和CD69+T细胞(右)中供体与宿主来源细胞的百分比

F:GVHD病变中CD3和溶解颗粒和CD3和细胞因子(IFN-γ;底部)的免疫荧光图像。

G: 免疫荧光标记和X/Y-FISH识别供体和宿主T细胞中穿孔素、颗粒酶B和IFN-γ阳性。

H:移植物抗宿主病病变中FoxP3+T细胞的供体/宿主嵌合体(左)以及供体和宿主T细胞之间Tconv(FoxP3-)与Treg(FoxP3+)(右)的比率。

I:移植物抗宿主病病变中CD3和转录因子FoxP3的免疫荧光染色。每个数据点代表一名患者两次独立测量的平均值。

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