免疫检查点（Immune checkpoint）是免疫系统的调节器。这些通路对自我耐受至关重要，自我耐受可以防止免疫系统不加选择地攻击细胞。肿瘤细胞或肿瘤组织往往会利用一些手段激活免疫检查点，使抗原不能被T细胞识别，从而抑制了T细胞的免疫学作用，逃避了机体的免疫监视。针对肿瘤免疫逃逸开发的抗肿瘤免疫疗法中，免疫检查点阻断剂已被证实对多种癌症治疗相当有效。然而，基于中枢神经系统独有的解剖结构和免疫环境，针对脑胶质瘤患者的IC靶向治疗仍处于起步阶段，但是仍表现出了可观的治疗潜力。

2022年11月，四川大学华西医院神经外科团队在Clinical Immunology上发表文章。

实验使用转录组和多色免疫荧光样本分析技术检测ICs的特征。我们发现B7-H3随着年龄和级别的上升而增加，并在转录和蛋白质组水平预测较差的总生存(OS)。

VISTA和PD-L1在RNA水平上与OS和分级相关。

在蛋白质水平上，VISTA主要在肿瘤细胞和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）中表达。B7-H3、VISTA与PD-L1呈正相关。PD-L1与CD3、Vista与IBA-1有很强的相关性。在T细胞中，我们发现ICs有很强的相关性，而TAMs和肿瘤细胞的相关性更差。总之，B7-H3是免疫治疗的重要预后指标。为脑胶质瘤的免疫抑制微环境提供了一个潜在的机制。

B7-H3是文中进行协同研究的另一个肿瘤免疫治疗的靶标，其表达水平也影响着肿瘤的迁移和侵袭。本文作者表示，B7 - H3在细胞的胞浆和胞膜均有表达，在蛋白水平上，其表达情况与胶质瘤的级别增加有关，并预示着更差的总体生存率，先前的研究结果和转录组水平数据也证明了这点。

V-domain Ig suppressor of T cell activation（VISTA） ，亦称PD-1H、B7-H5，与CTLA-4、PD-1/PD-L1一样属于B7家族分子，是近来研究较为火热的抑制性免疫检查点。CTLA-4表达于T细胞活化后不久，在T细胞致敏阶段限制协同刺激/抑制T细胞活化；PD-1表达于T细胞致敏后，在效应阶段抑制T细胞；VISTA很特别：以组成型表达于naïve T cell，能独立抑制T细胞活化以维持T细胞静息状态，相对在T细胞免疫作用中处于上游控制阶段，其重要性不言而喻。

实验部分

使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统获取图像。获取到图像利用StrataQuest软件进行定量分析。

肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的计划以及空间分布，与肿瘤患者的预后生存密切相关，已经被发现其可以作为免疫微环境中的重要靶点，调节肿瘤相关的免疫反应。

在之前转录组水平的研究数据中发现，IBA-1+TAMs与VISTA具有相关性，但是缺乏单细胞蛋白水平的研究佐证。本文中，研究者通过TissueFAXS Cytometry技术，首次在蛋白水平发现VISTA与IBA-1+的TAMs在胶质细胞瘤中存在单细胞共表达情况，在TAMs和肿瘤细胞中，VISTA可能发挥着更为重要的作用，这个发现为今后作用于免疫治疗靶点的调控机制带来了新的探索思路。

在TAMs研究过程中，TissueGnostics公司根据用户需求，推出了《肿瘤相关巨噬细胞研究白皮书》，书中阐述了TAMs研究的意义，以及最重要的常见TAMs多重染色Panel，包括其染色方法、推荐抗体、使用TG技术发表的高分文献——相比传统的IF免疫荧光，TissueFAXS Cytometry可以在一张样本上进行10种特异性蛋白标记，并对单水平的细胞蛋白表达量进行精准量化分析。

TissueFAXS Cytometry技术在单细胞水平的研究中，针对单个细胞可以分别定量其蛋白在细胞质、细胞膜中的表达强度，为研究者对单细胞组学中蛋白表达空间验证的细化研究提供了帮助。

实验步骤：

利用光谱库进行光谱拆分，获得单通道荧光信号。DAPI通道识别单细胞。以细胞核为中心，根据每个蛋白的染色情况设定距离半径，得到每个蛋白的荧光染色信号。然后，根据每个通道的染色情况设定阈值，划分阳性细胞群，计数阳性细胞。同时还计算了双阳性细胞的数量和强度。平均染色强度乘以阳性细胞数量，并将它们除以总细胞数得到基因表达平均值。

Fig 1：多重免疫荧光定量胶质瘤中VistA、B7H3、PDL1、CD3、IBA-1和GFAP的表达水平。

显示不同级别胶质瘤的Vista、B7H3、PDL1、CD3、IBA-1和GFAP的多重免疫荧光图像。

Fig 2 ：PD-L1、B7-H3、Vista与CD3、IBA-1、GFAP在脑胶质瘤中的位置关系。

(A)PD-L1与蛋白在脑胶质瘤中的表达、定位和共定位。

(2)VISTA与蛋白在脑胶质瘤中的表达、定位及共定位。

(C)B7-H3与蛋白在脑胶质瘤中的表达定位和共定位。

(D)B7H3、VISTA和PD-L1的表达情况。

不同基因在脑胶质瘤中的表达水平。

PD-L1、B7-H3、Vista与蛋白的共定位关系。

(A)   PD-L1与B7-H3呈正相关。(2)Vista与PD-L1呈正相关。(3)VISTA与B7-H3呈正相关。(D)IBA-1与CD3呈正相关。(F)GFAP与Iba-1的相关性(R2=0.00044，p=0.79)(G)CD3与PD-L1呈显著正相关 (H) Iba-1与PDL1呈正相关 (J)B7-H3与CD3呈正相关 (K)B7-H3与IbA-1呈正相关(L)B7-H3与GFAP呈负相关(M)VISTA与CD3呈正相关(N)B7-VistA与IBA-1呈正相关。