近期，耶鲁大学医学院的研究人员利用TissueFAXS Cytometry系统完成免疫细胞原位表征的定性定量分析的文章，成功刊登在澳洲生物学网站News Medical上并且迅速登上Google搜索前位。

如今，由于单细胞成像和定量分析技术的迅猛发展，人们已经可以做到在组织原位中检测免疫细胞。 但是，基于传统荧光成像的显微观测技术受限于可见光光谱范围，通常只能同时标记、检测四种生物标志物，从这个角度来说，我们对于细胞状态的理解仍然不全面。

借助于流式细胞术，人们可以在液流中同时检查多个染色的生物标志物，但它也会丢失细胞原始的形态结构，以及与其组织有关的微环境信息（tissue microenvironment）。

因此，建立一种既可以提供多细胞生物标志物的数据信息，同时又保留组织细胞微环境信息的技术（就像常规显微镜一样），在满足当代临床科研的严格要求方面，将具有很大优势。

实验概述

实验样本来自Marcus Bosenberg博士开发的黑色素瘤小鼠模型中脾脏的组织样本，由本文作者Kim Blenman博士分离出小鼠脾脏。Blenman使用福尔马林固定石蜡包埋的脾脏组织切片，利用Cy3和Cy5染料染色，并进行了荧光显微成像观察。Blenman主要关注点在于CD4跨膜蛋白（多种T细胞亚型的生物标记物）以及六种其他细胞活性的标志物——包含与这些细胞相关的增殖和转录功能。

本实验利用了多轮染色技术，在每一轮染色之间，使染料失活，这样可以获得细胞上的不同生物标志物的染色情况，例如Foxp3，Granzyme B，IL-6，Ki-67，RORγ（t）和T-bet。

 Blenman博士所做的这种多轮染色技术，其实是TissueGnostics公司的TissueFAXS Cytometry全景组织细胞定量分析技术一个应用分支。利用该技术，不但可以获得每轮染色的高倍率全景图像，更重要的是可以把每轮染色图像进行拟合，获得组织原位单细胞多重染色标记的图像后，再利用StrataQuest软件分析。

该技术首先利用一种算法将拼接好的全景图像拟合在一起，从而重新创建一个合成图像，包含每轮染色回合中的单个细胞每个通道的生物标记信息。在每个通道的单细胞识别层面，StrataQuest软件生成的虚拟影像中，采用两种不同的模式进行识别：一种用来识别细胞核，另外一种用于鉴定细胞表型的生物标记。随后，通过确定目的蛋白的阳性率，最终而完成整个定量分析。

在定量分析过程，使用的是“Backgating”反向回溯功能。根据原始图像中信号表达的微小差异，准确确定cutoff线阈值的设置位置，进而区分阴阳性细胞。类似于流式细胞技术中从直方图或散点图中“gating”设门圈选功能，但是可以做到反向“gating”在原始图像中实时校验圈选的范围与结果。

Blenman博士将其用于脾脏组织样本，证实一次就可以在组织原位单细胞水平获得多种生物标志物信息。根据细胞个体和簇表达的生物标志物的不同组合，将这些细胞归类。通过这种方式，Blenman团队证明了细胞簇中CD4表达的水平与生物标志物表达的模式、细胞增殖之间的关联。

预见未来

免疫系统是异常复杂的，传统荧光显微成像针对每个细胞只能分析四种生物标志物，对于免疫方向的研究是一个较大程度的限制。而TissueFAXS Cytometry的多轮多重染色标记技术，以常规显微成像为基础，不但可以使用实验室常规染料，染色技术也无需特殊培训，非常易于使用。尽管本文作者此次分析了6种生物标志物，但理论上讲，同时分析生物标记物的数量是没有限制的。