红细胞生成岛（Erythroblastic islands，EBIs）是骨髓中的特定结构，包括中央巨噬细胞，在终末分化的不同阶段被红细胞前体包围。但在肿瘤中从未被发现具有功能。肝母细胞瘤(HB)是儿科最常见的肝脏恶性肿瘤，需要更有效、更安全的治疗方法来预防疾病进展和并发症对幼儿的终生影响。然而，由于缺乏对肿瘤微环境的全面了解，此类疗法的开发受到阻碍。

2023年5月16日，中山大学附属第一医院精准医学研究与小儿外科联合在Cell Reports Medicine 上发表了题为“Intratumoral erythroblastic islands restrain anti-tumor immunity in hepatoblastoma”的研究论文。本研究提供了乙肝免疫微环境的单细胞图谱，确定了EBI在调节免疫抑制的肿瘤免疫微环境中的作用。

通过对13个未接受治疗的HB患者进行单细胞RNA测序，我们发现了一种免疫特征，由VCAM1+巨噬细胞和红细胞形成的EBIs的异常积累，且与HB的生存率呈负相关。红系细胞通过LGALS9/TIM3轴抑制树突状细胞(DC)的功能，导致抗肿瘤T细胞免疫应答受损。但是，TIM3阻断缓解了红细胞对DCs的抑制作用。该研究提供了一种由肿瘤内EBIs介导的免疫逃逸机制，并提出TIM3作为HB的一个有前途的治疗靶点。该结果可能有助于开发更安全、更有效的免疫疗法来治疗患有乙肝的儿童。

实验部分

1 本文使用TissueGnostics公司TissueFAXS Spectra全景多光谱组织扫描定量分析系统HB组织样本进行多色荧光图像采集。利用光谱库进行光谱拆分，获得单通道荧光信号。DAPI通道识别单细胞。以细胞核为中心，根据每个蛋白的染色情况设定距离半径，得到每个蛋白的荧光染色信号。然后，根据每个通道的染色情况设定阈值，划分阳性细胞群，计数阳性细胞。

2 利用Tissue Cytometry技术对数据进行空间共定位分析。计算感兴趣的细胞之间的距离和每对细胞表型的相互邻居的数量(最大距离为25 mm)。为了调节红系细胞的密度，我们计算半径25 mm范围内LGALS9+红系细胞周围TIM3+DC的密度，然后除以肿瘤内LGALS9+红系细胞的密度。从而得到每个LGALS9+红系细胞附近TIM3+DC的数量。

3 Flow Cytometry技术专注于对液流中单个细胞进行精准的量化分析，但是无法获得组织原位的细胞形态以及细胞分布关系；Tissue Cytometry技术基于全景多光谱成像的技术原理，可以获得组织原位单细胞量化分析的同时，不但分析目标精确到细胞核/质等亚细胞水平的精度，更可以通过其与肿瘤的空间分布关系，对目标在真实生物体中的位置作用进行量化分析。

本文作者联合使用Flow Cytometry技术和Tissue Cytometry技术，针对体外/体内的目标红系细胞分别进行了细胞数量与荧光强度的对比分析，尤其是在Tissue Cytometry技术中，更获得了TME原位空间表型分析数据，结合TSA多重免疫荧光技术，对LGALS9 +红系细胞和 TIM3 + DC之间的空间作用关系进行了探索，发现了一种以EBI异常积累为特征的免疫环境的存在，为后续进一步实验打下了坚实基础。

Fig 1 VCAM1+巨噬细胞与红系细胞形成EBIs

(F) 乙肝肿瘤的多重免疫荧光图像，箭头指向EBI结构，由CD68+VCAM1+巨噬细胞和周围的CD45-Gypa+红系细胞组成。

(G) HB肿瘤及邻近肝脏样本中红系细胞与VCAM1+巨噬细胞的距离(左)和红系细胞与VCAM1+巨噬细胞的比例(≤25 um)。

Fig 2 肿瘤内红系细胞通过LGALS9/TIM3轴抑制DC的抗肿瘤功能

(D) HB肿瘤的多色免疫荧光染色图像，显示红系细胞(LGALS9+Gypa+，用红色箭头标记)与DC(CD11c+TIM3+，用橙色箭头标记)之间的相互作用。