新型StrataQuest定量分析方法:探索胞内原生生物与宿主细胞关系

探究宿主-病原体相互作用特点是研究微生物与免疫学方向学科的重要方法。宿主细胞吞噬病原体后其表征将会改变,多数研究主要利用宿主细胞或者细胞系在体外实现,说明RNA的表达或细胞培养中回收的蛋白质的情况。实验条件下,所有的宿主细胞拥有相同数量病原体具有合理性。然而,利用吞噬细胞的病原体吸收是不同步的。所以,包含了不同数量病原体的宿主细胞导致不同致病菌诱导的蛋白质生物合成。

本实验应用免疫荧光标记分析方法检测与宿主细胞相关的病原体的数量。结合多marker染色,分析宿主细胞种群的感染情况和寄生负荷结果(相关宿主细胞的表型)。随着单克隆抗体和荧光标记试剂的产生,宿主细胞在进程中的变异研究增多。

事实上,已有实验利用多通道流式细胞术和荧光显微技术来检测寄生虫与宿主细胞关系,但两种方法均有不足。流式细胞分析术(FACS)能够检测拥有寄生虫的宿主细胞的表型,但不能精确到单细胞中寄生虫的数量且不能做到细胞原位的定位。荧光显微技术的准确性更高,原位表面marker的表达情况能够筛选拥有寄生虫的宿主细胞。但是,宿主细胞寄生负荷marker强度的高度客观仍然存在困难。

因此,一种能够将单细胞定量和宿主细胞表型分析相结合的技术是十分必要的。


实验方法

利用TissueQuest和StrataQuest软件同时满足单细胞定量分析和宿主细胞表型分析。以Dot-Finder专利运算法为核心的全景组织细胞定量分析技术,分析感染了L.major的原位及体外巨噬细胞。

与流式细胞术(FACS)相比,荧光标记marker的强度能够在原位单细胞级别定量且不需要制备细胞悬浮液。TissueQuest软件能够实现从实验数据精确反向回溯到影像中的细胞。反向回溯的特征可以用来检测原位细胞亚群,设门的细胞定位(DAPI,AF546(CD11b)和Cy5(F4/80)。通过调节核的尺寸,面积和灰度值完成软件分析。反向回溯实时观察创建的阳性细胞散点图。根据细胞尺寸和染色强度确定cut-off值。检测DAPI的阳性值和细胞中活性L.major,利用ring mask功能创建DAPI通道。

实验数据

淋巴腺体部分的胞内病原体检测

细胞核识别和ring mask计算

单通道影像获取,利用四通道进行荧光检(DAPI,FITC,Rhodamin,Cy5),每个影像包含将近50-200个细胞,并且扫描部分图像自动拼接。每个荧光通道的影像和多个FOV都能够被自动获取,收集和后期的组合。(A) 利用参数调节识别细胞核(B) 创建ring mask (C) ring mask中黄色高亮部分为自动筛选ROI中病原体

Ring mask中的L.major病原体识别


根据活性病原体的微弱信号和复杂的背景信息识别病原体

Parasite finder预设程序可根据用户需要选择方法最高程度的区别背景与待分析部分。

(A) ring mask胞质部分,代表缺少病原体培养的条件下的巨噬细胞。(B) 蓝色部分为感染的巨噬细胞的ring mask,黄色箭头标出DAPI的阳性信号。(C) 黄色部分微弱信号区分未感染的巨噬细胞的ring mask中的伪信号。(D)创建伪阳性信号。多于30个病原体的巨噬细胞被标出。(E)检测微弱信号区分没有被感染的巨噬细胞的ring mask中的非伪信号。(F)所有被感染的巨噬细胞(黄色部分和黄色箭头)均被识别出。

感染的巨噬细胞病原体密度和感染比例


(A)软件自动计算感染与未感染的巨噬细胞。(B)每个巨噬细胞胞内寄生虫的平均数量的定量分析。在分析了237个与8639个细胞后,得出随即选择的样本足以证明总感染比例的正确性。(C)胞内寄生虫与巨噬细胞的关系。胞内病原体的数量和Y轴相应的病原体对应的巨噬细胞拥有病原体的数量区间。

此图阐明巨噬细胞中的活病原体的高度混杂性。推测原因为多样化的吞噬作用和病原体繁殖的加强。巨噬细胞的表型决定胞内病原体扩张存在可能性。

感染与未感染的原位巨噬细胞定量分析骨髓细胞marker表达

(A) 直方图表示X轴巨噬细胞拥有病原体与Y轴病原体的数量。分析得到细胞核,ring mask,ring mask中的病原体,ring mask中的CD11b或者F4/80的强度表达(B) 拥有不同数量病原体的巨噬细胞的平均强度分析。估算每个成核原位宿主细胞。


体外原位成活与失活胞内病原体的诊断


体外活细胞和死细胞的定量分析

失活病原体不能够标记DAPI,所以软件能够识别宿主细胞中不同的病原体。对样本进行EB-AO平行染色。StrataQuest识别细胞的胞质(绿色),细胞与细胞接触部分(橘色)。

(A) AO灰阶图用于薄膜的检测(绿色),细胞边缘的确定(橘色)。(B) 对粘连细胞进行详细分析。(C) 反向回溯确定巨噬细胞拥有多于2个失活寄生虫。(E) 拥有失活寄生虫的巨噬细胞的频率分析。(F)拥有不同数量失活寄生虫的吞噬细胞的频率分析。



此图为寄生负载的评估。(A) 被感染的淋巴腺, 灰阶图为DAPI+宿主细胞核和寄生虫DNA。(B) 胞核,胞浆和寄生虫的重叠影像(C)(D) 反向回溯拥有3和5-10寄生虫的细胞(E)感染细胞的寄生负载。

DAPI的信号识别病原体的DNA并未退化,活检,干燥前的病原体仍然具有活性。识别胞核(橘色)和核膜(绿色)。DAPI阳性病原能够在宿主细胞的胞浆部分进行识别。

后续研究中会在宿主-寄生虫的联系的分子反应机理,微生物方向疾病治愈做出提高。



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