耶鲁大学医学院| TissueFAXS Cytometry技术探秘单个免疫细胞微环境

近期,耶鲁大学医学院的研究人员利用TissueFAXS Cytometry系统完成免疫细胞原位表征的定性定量分析的文章,成功刊登在澳洲生物学网站News Medical上并且迅速登上Google搜索第一名的位置。

如今,由于单细胞成像和定量分析技术的迅猛发展,人们已经可以做到在组织原位中检测免疫细胞。 但是,基于传统荧光成像的显微观测技术受限于可见光光谱范围,通常只能同时标记、检测四种生物标志物,从这个角度来说,我们对于细胞状态的理解仍然不全面。

借助于流式细胞术,人们可以在液流中同时检查多个染色的生物标志物,但它也会丢失细胞原始的形态结构,以及与其组织有关的微环境信息(tissue microenvironment)。

因此,建立一种既可以提供多细胞生物标志物的数据信息,同时又保留组织细胞微环境信息的技术(就像常规显微镜一样),在满足当代临床科研的严格要求方面,将具有很大优势。


实验概述

实验样本来自Marcus Bosenberg博士开发的黑色素瘤小鼠模型中脾脏的组织样本,由本文作者Kim Blenman博士分离出小鼠脾脏。Blenman使用福尔马林固定石蜡包埋的脾脏组织切片,利用Cy3和Cy5染料染色,并进行了荧光显微成像观察。Blenman主要关注点在于CD4跨膜蛋白(多种T细胞亚型的生物标记物)以及六种其他细胞活性的标志物——包含与这些细胞相关的增殖和转录功能。

本实验利用了多轮染色技术,在每一轮染色之间,使染料失活,这样可以获得细胞上的不同生物标志物的染色情况,例如Foxp3,Granzyme B,IL-6,Ki-67,RORγ(t)和T-bet。

 Blenman博士所做的这种多轮染色技术,其实是TissueGnostics公司的TissueFAXS Cytometry全景组织细胞定量分析技术一个应用分支。利用该技术,不但可以获得每轮染色的高倍率全景图像,更重要的是可以把每轮染色图像进行拟合,获得组织原位单细胞多重染色标记的图像后,再利用StrataQuest软件分析。

该技术首先利用一种算法将拼接好的全景图像拟合在一起,从而重新创建一个合成图像,包含每轮染色回合中的单个细胞每个通道的生物标记信息。在每个通道的单细胞识别层面,StrataQuest软件生成的虚拟影像中,采用两种不同的模式进行识别:一种用来识别细胞核,另外一种用于鉴定细胞表型的生物标记。随后,通过确定目的蛋白的阳性率,最终而完成整个定量分析。

在定量分析过程,使用的是“Backgating”反向回溯功能。根据原始图像中信号表达的微小差异,精准确定cutoff线阈值的设置位置,进而区分阴阳性细胞。类似于流式细胞技术中从直方图或散点图中“gating”设门圈选功能,但是可以做到反向“gating”在原始图像中实时校验圈选的范围与结果。

Blenman博士将其用于脾脏组织样本,证实一次就可以在组织原位单细胞水平获得多种生物标志物信息。根据细胞个体和簇表达的生物标志物的不同组合,将这些细胞归类。通过这种方式,Blenman团队证明了细胞簇中CD4表达的水平与生物标志物表达的模式、细胞增殖之间的关联。


预见未来

免疫系统是异常复杂的,传统荧光显微成像针对每个细胞只能分析四种生物标志物,对于免疫方向的研究是一个极大的限制。而TissueFAXS Cytometry的多轮多重染色标记技术,以常规显微成像为基础,不但可以使用实验室常规染料,染色技术也无需特殊培训,非常易于使用。尽管本文作者此次分析了6种生物标志物,但理论上讲,同时分析生物标记物的数量是没有限制的。

Blenman博士指出,这种方法的优势在于能够在单细胞水平多标记、客观地量化细胞生物标志物。因为针对个体疾病及其潜在机制的靶向治疗的数量有所增加,该方法在癌症治疗中也是非常有效的( Cytometry Part A)。

该方法具备流式细胞术的设门圈选功能,但额外提供反向回溯和散点图直方图数据呈现方式的功能,同时又可以保留空间位置信息。


TissueGnostics的创新

Blenman博士应用TissueGnostics公司TissueFAXSCytometry技术,成功将文章发表在Cytometry Part A 杂志上。该技术兼顾高效,高自动化的工作流程,同时可以与MATLAB脚本整合。此外,还可提供50多个针对特定研究方向的APP(数量还在不断增加)。 每个APP都可以提供完善的分析工作流程,并提供多种数据报告形式。

TissueFAXS Plus是一款高兼容性的正置系统,能够扫描和分析细胞涂片,玻片,涂片和TMA样本。除常规配置外,支持多种形式定制(共聚焦/多光谱/高通量/全自动显微工作站等)。


同时可选配以下三个软件之一,HistoQuest,TissueQuest和StrataQuest。StrataQuest是其中最全面和最先进的分析软件。StrataQuest可以自动识别特定组织结构(例如血管/神经/腺体/肿瘤等),并可以识别和定量细胞样本中的所有个单细胞。取决于全景虚拟切片的大小,一个样本中可以定量分析的单个细胞数量,在数万个到数千万个细胞不等,远远高于其他单细胞定量分析系统。


References


Blenman KRM &Bosenberg MW. Immune Cell and Cell Cluster Phenotyping, Quantitation, andVisualization Using In Silico Multiplexed Images and Tissue Cytometry.Cytometry A. 2019; 95:399-410. doi: 10.1002/cyto.a.23668.


News Medical(2018). Image Cytometry Technology and Tissue Analysis. Available at:https://www.news-medical.net/news/20180904/Image-Cytometry-Technology-and-Tissue-Analysis.aspx.Accessed: Aug 2019.


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